Способы и режимы стерилизации питательных сред, воды и посуды

Стерилизацией называется полное уничтожение микроорганизмов в каком-либо объекте: питательных средах, воде, посуде, инструментах и др.

Все подготовленные среды, вода для разведения, а также чистая посуда, применяемая для посева и выращивания микроорганизмов (пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы), перед началом микробиологических исследований должны быть обязательно простерилизованы. Питательные среды стерилизуются тотчас после приготовления. Колбы и пробирки с питательными средами и водой перед стерилизацией закрывают ватными пробками. Ватные пробки выполняют роль фильтров и предохраняют простерилизованный материал от попадания посторонних микроорганизмов из воздуха.

Пробки должны быть прочными и долгое время сохранять свою форму. Ватные пробки можно готовить с помощью специальной машины для изготовления пробок. При отсутствии машины пробки готовят следующим образом: кладут на стол тонкий ровный слой ваты, загибают внутрь боковые края и получают ленту, по ширине равную длине пробки. Затем из этой ленты скатывают валик диаметром несколько меньше диаметра сосуда (рис. 13).

Ватные пробки обычно обертывают кусочком марли в один слой. Пробка должна хорошо и достаточно плотно входить в горло сосуда и выступать из него примерно на 3 - 4 см, чтобы ее легко было захватить пальцами.

Рис. 13. Приготовление пробок.

 

Пипетки, используемые для микробиологических работ, перед стерилизацией завертывают в бумагу. В широкий конец пипетки обычно вводится препаровальной иглой небольшой кусочек ваты так, чтобы ворсинки не выступали из отверстия пипетки. Бумага для завертывания пипеток отрезается длинными лентами шириной 5-10 см. Суженый конец пипетки кладут на край ленты под углом в 35-40° и концом ленты тщательно закрывают его. Затем завернутый конец пипетки зажимают пальцами левой руки и вращательными движением правой руки завертывают пипетку.

Иногда пипетки не завертывая помещают по нескольку штук в специальные металлические или стеклянные пеналы. Ватная пробка в пипетках обязательно должна сохраняться при их использовании, во избежание попадания в посеве посторонних микроорганизмов из ротовой полости. Чистую сухую посуду (чашки завернутые в бумагу) чаще всего стерилизуют в электросушильных шкафах «сухим жаром» при t - 150-160 °С в течение 1, 5-2 часов. При таком режиме, как правило, убиваются не только вегетативные клетки микроорганизмов, но и наиболее термоустойчивые споры бацилл. После стерилизации посуду хранят завернутой в закрытых шкафах до момента использования.

Для питательных сред и воды используют стерилизацию нагретым паром. Различают два типа такой стерилизации: 1 )стерилизация текучим паром и 2) стерилизация насыщенным паром под давлением.

Стерилизация текучим паром производится в кипятильнике Коха (или в автоклаве при открытом кране для выпуска пара). Аппарат Коха - это металлический цилиндр, накрываемый сверху крышкой с отверстием в ней для свободного выхода пара. На дно аппарата наливают воду и ставят подставку, на которую помещают стерилизуемые предметы.

Текучим паром осуществляют дробную стерилизацию (тиндализацию), которая производится при температуре 100 °С в течении 3-х дней подряд по 30-40 минут ежедневно. В промежутках между прогреваниями питательные среды оставляют при комнатной температуре или выдерживают в термостате для того, чтобы споры, которые оставались после кипячения, могли прорасти в вегетативные клетки, а возникающие молодые клетки уничтожают при повторном нагревании.

Недостатком тиндализации является ее длительность. Однако этим методом широко пользуются в лабораторной практике. Он является незаменимым для стерилизации сред, изменяющих свой состав и свойства при температуре выше 100 °С. Дробно стерилизуют молоко, среды с углеводами, среды с желатиной и др. Метод дробной стерилизации введен английским ученым Тиндалем.

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является самым быстрым и наиболее надежным способом. Она осуществляется в специальном приборе - автоклаве (рис. 14), который представляет собой двустенный герметически закрывающийся котел. Он снабжен воронкой для наливания воды, краном для выпуска воздуха и пара, манометром для определения давления пара внутри котла и предохранительным клапаном.

При стерилизации в автоклаве порядок работы следующий:

1.Заливают через воронку воду до метки (уровень воды виден через водомерное стекло) и внутрь на специальную подставку помещают стерилизуемые предметы.

2.Закрывают крышку автоклава и открывают кран для выхода воздуха и пара.

3.Включают автоклав в электрическую сеть.

4.После закипания воды начинает выходить сильная струя пара из крана. После полного удаления воздуха паром (продувка автоклава) закрывают кран и следят по манометру за давлением. Время стерилизации отмечают с момента установления необходимого давления. Большинство питательных сред, а также водопроводную воду в автоклаве стерилизуют при 1 атм в течении 20-30 мин., что соответствует t = 121 °С. Такая температура убивает не только бактерии, но и их споры. Легко разрушающиеся и карамелизующиеся среды (молоко, сусловый агар, агар Чапека и др.) стерилизуют в автоклаве при 0, 5 атм в течение 20-30 мин., что соответствует t = 112 °С.

5. После окончания стерилизации автоклав отключают, осторожно выпускают пар, отвинчивают крышку и достают простерилизованные материалы.

Если кран будет открыт слишком рано, то стерилизуемая жидкость может вскипеть и выбросить ватные пробки.

Холодная стерилизация осуществляется фильтрованием через специальные мелкопористые фильтры в заранее простерилизованную посуду. Этот прием холодной стерилизации применяется для тех питательных сред, которые изменяют свой состав и свойства даже при незначительном нагревании.

Сущность этого метода стерилизации основана на том, что малые поры фильтра легко пропускают раствор, но задерживают микроорганизмы, за исключением ультрамикробов (вирусов и бактериофагов).

Бактериальные фильтры готовят из разных материалов. Наиболее часто употребляются фильтры из фарфоровой глины, асбеста и мембранные ультрафильтры. Химический метод стерилизации называется дезинфекцией. Дезинфекция - это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильно действующих химических веществ-антисептиков.

Бактерицидное действие проявляют многие окислители: хлор, перекись водорода, пермаганат калия, неорганические кислоты – сернистая борная, органические соединения – формалин, фенолы, этиловый и бутиловый спирты и др.

В лабораторной практике дезинфекцию применяют для обеззараживания рабочего стола, рук, инструментов и т.д.

Задание

1. Приготовить МПА (из сухого концентрата), сусло-агар, среду Чапека. Установить нужную рН. Сделать ватные пробки. Разлить среды в колбы и пробирки (1/3 объема) сдать в стерилизацию.

2. Подготовить к стерилизации посуду - чашки Петри, пипетки, пробирки.

3. Ознакомится с работой автоклава и других способов, применяемых для стерилизации питательных сред, воды и посуды.

Работа 6. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА И АНАЛИЗА СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ РАЗНЫХ ВИДОВ ПИЩЕВОГО СЫРЬЯ, ПОЛУФАБРИКАТОВ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ

Наиболее простым и широко распространенным методом количественного учета микроорганизмов в указанных объектах является стандартный метод подсчета выросших колоний на плотных питательных средах в чашках Петри.

Культивирование микроорганизмов на питательных средах осуществляется посевом. Посевом называется внесение в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для выявления в нем микроорганизмов. Посевы применяются для определения количественного и качественного состава микрофлоры в любом исследуемом объекте: воде, пищевых продуктах, воздухе помещений, поверхности оборудования и т.д.

Посев на плотные питательные среды (МПА, сусло-агар и др.) в чашках Петри проводят двумя способами: глубинными или «газоном».

При глубинном посеве стерильную питательную среду расплавляют на кипящей водяной бане, затем охлаждают до температуры 40-45 °С и заливают, предварительно внесенной на дно чашки Петри посевной материал, примерно 10 мл среды.

Внесенная среда равномерно перемешивается с посевным материалом, путем осторожного вращения (или покачиванием) чашки на ровной поверхности стола. Чашку оставляют на столе до полного застывания среды, на крышке восковым карандашом или специальными чернилами делают соответствующую надпись. Глубинный посев применяют постоянно для учета микроорганизмов в посевах смывов с различных объектов: сырья, пищевых продуктов, оборудования и т.п. Микробные клетки при глубинном посеве попадают на дно чашки под слой агара, а также на его поверхность. Из клеток образуются колонии разной формы, размера, окраски и т.п., которые затем подсчитываются и изучаются.

При посеве «газоном» предварительно расплавленную среду разливают (по 10-12 мл) в стерильные чашки Петри. На застывшую среду посев микроорганизмов производится петлей в виде параллельных штрихов или внесенный материал равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Посев «газоном» применяют для выделения чистых культур микроорганизмов из одной колонии, а также при изучении внешнего вида колоний разных видов. Указанный способ используется также для учета микроорганизмов в воздухе (метод оседания).

Все посевы помещают в термостат для выращивания. Во избежание попадания на поверхность конденсационной влаги чашки с посевами укладывают в термостат перевернутыми вверх дном.

Для роста и размножения микробов на питательных средах необходимы определенные температурные условия. Дрожжевые и мицелиальные грибы, а также многие сапрофитные бактерии относятся к группе мезофилов, т.е. оптимальной температурой для их развития является 25-30°С. Патогенные микробы лучше растут при температуре 37°С.

Существуют микробы, требующие более низких или более высоких температур для своего развития. Так, например, температурный оптимум психорофилов (холодолюбов) 6-10°С, а температурный оптимум для термофилов достигает 50-60 °С. Все различия в биологии микроорганизмов необходимо учитывать при их культивировании, в связи с чем посевы выращиваются в термостатах, который представляют собой шкафы, где поддерживаются соответствующая постоянная температура с помощью специальных терморегуляторов.

Для определения количества микроорганизмов в единице массы (в 1г.) любого продукта, непосредственно в колбу Эрленмейера со 100 мл. стерильной водопроводной воды берут навеску продукта массой от 5 до 10 г. (взвешивают на технических весах с точностью до 1 г.). Затем производят смыв путем взбалтывания пробы в колбе в течение 10 мин. горизонтальными, кругообразными движениями (при этом нельзя смачивать ватную пробку). Получаем 1-ое разведение количества микроорганизмов 1: 100. Далее осуществляется разведение путем разбавления полученного смыва в 1000, 10000 и более раз стерильной водой. Для этой цели берут несколько пробирок с 9 мл. стерильной воды в каждой. Стерильной пипеткой вносят 1 мл смыва из колбы в первую пробирку и тщательно перемешивают. Получают разведение 1: 1000 из первой пробирки той же пипеткой переносят 1 мл во вторую и получают разведение 1: 10 000 и т.д.

Из полученных разведений делают посев по 1 мл. в две стерильные, заранее подписанные чашки Петри. Схема разведений, посев и разливка агара в чашки представлены на рис. 15. следует отметить, что чем больше взято пробирок для разведений, тем больше будет ошибка в конечном подсчете количества микроорганизмов в 1 г. продукт. Внесенный в чашки материал (1 мл смыва) заливают соответствующей, предварительно расплавленной и охлажденной до t 40-45°С, питательной средой. Одну из двух чашек заливают МПА – для вырвщивания колоний бактерий, другую – СА – для выращивания грибов. После застывания среды перевернутые чашки помещают в термостат при t = 28-30° на 48-72 часа. Выросшие на агаре колонии подсчитывают со стороны дна чашки. При этом условно считается, что каждая колония развилась из отдельной микробной клетки. каждую отсчитанную колонию помечают, нанося на ней чернилами точку. Разведение и посев считаются правильно выбранными, если в чашке выросло от 100 до 500 колоний бактерий и от 20 до 50 колоний грибов.

Чашки, в которых выросло менее 10 колоний бактерий и менее 5 колоний плесеней – в расчет не принимаются. Подсчитав количество колоний на чашке, определяют число микроорганизмов (бактерий и грибов отдельно) в 1г продукта по уравнению: A=(b × c)/d, где А-количество микроорганизмов в 1г продукта; b-число колоний на чашке; c-разведение (1: 100; 1: 1000 и т.д.); d-навеска продукта (г).

Например, при подсчете на чашке обнаружено 320 колоний, разведение 1000, навеска продукта 5г. Определяем количество микроорганизмов в 1г продукта: (320 × 1000)/5 = 64000 или 6, 4 × 10⁴КОЕ/г.

Если на чашке выросло столько колоний, что их трудно подсчитать, то счет модно проводить следующими методами:

По секторам дно чашки расчерчивают карандашом на несколько одинаковых секторов. Затем пересчитывают колонии в 2-3 секторах и среднее число, найденное для одного умножают на количество секторов; Если на чашке с крайним разведением количество колоний подсчитать невозможно, то пользуются счетными камерами. Счетная камера Вольфюгеля представляет собой стеклянную пластину, разделенную на квадраты с площадью 1 см² (Рис. 16).

Опрокинутую вверх дном чашку Петри кладут на стеклянную пластинку и считают число колоний в 10 квадратах, расположенных в 2-х взаимно перпендикулярных направлениях. После того как подсчитано количество колоний в 10 квадратах, выводят среднее число на один квадрат (1 см²).

Для определения количества колоний на поверхности всей чашки число колоний в 1 см² умножают на площадь чашки, равной pr² (для чашки диаметром 10 см радиус = 5 см).

 

 

Рис. 14 Автоклавы:

а) вертикальный; б)горизонтальный

 

Рис. 15 Схема разведений и разливка агара в чашки Петри

 

Если в одном квадрате подсчитано 30 колоний, то на всей чашке будет 30 х pr² = 30 х 3, 14 х 5²= 2355 колоний.

Следует отметить, что наряду с доступностью и относительной достоверностью, метод количественного учета колоний имеет и существенные недостатки, которые следует учитывать при проведении работы.

Прежде всего, исходя из вида исследуемого продукта (свежие овощи, плоды, сырое мясо, рыба, полуфабрикаты, обезвоженные продукты и т.д.) нужно выбрать правильное разведение пробы.

Необходимо тщательное соблюдение правил отбора пробы продукта и проведение смыва стерильной водой. Следует заметить также, что метод позволяет учитывать лишь общее количество определенных групп сапрофитных мезофильных аэробных и факультативно-аэробных микроорганизмов (КМА-ФАНМ), но непригоден для учета анаэробов и некоторых других групп, бактерий.

Кроме метода учета колоний в микробиологической практике на пищевых предприятиях применяется также метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом. Микробные клетки подсчитывают в счетных камерах разных инструкций: Камера Горяева, Фукс-Розенталя, Тома-Цейса и др. принцип устройства их примерно одинаков (Рис.17).

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло с нанесенной на ней сеткой. Сетка разделена на определенное число больших и малых квадратов. Постоянной величиной во всех сетках является малый квадрат, сторона которого равна 1/20 мм, площадь его 1/400 мм².

Для определения процентного содержания мертвых клеток дрожжей в прессованных дрожжах, в заквасках, используемых в хлебопечении, в культурах пивоваренных дрожжей и др. берут каплю суспензии дрожжей наносят на сетку камеры подкрашивают метиленовой синей и накрывают покровным стеклом.

Капля под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетке. Камеру помещают на предметный столик микроскопа, с объективом 8, находят сетку и не передвигая ее, заменяют объектив 8 объективом 40. через 1-2 мин. подсчитывают число окрашенных (мертвых) и неокрашенных (живых) клеток в 10 полях зрения. Рассчитывают процентное содержание мертвых клеток.

Счетные камеры Горяева используются и для прямого подсчета бактерий, например молочнокислых бактерий в хлебопечении, а также для прямого подсчета в томатопродуктах.

Рис. 16. Счетная камера Вольфгюгеля.

 

Рис. 17. Счетная камера Горяева.

Выбор метода подсчета колоний на плотных средах, или прямого учета микробных клеток под микроскопом зависит от поставленной задачи и специ­фических особенностей исследуемых объектов. В некоторых случаях исполь­зуются одновременно оба метода.

Следует помнить, что при прямом подсчете бактерий учитываются не только живые, но и нежизнеспособные, а также мертвые клетки, что может вуа­лировать истинную обсемененность продукта микрофлорой. Культивирование на плотных питательных средах в сравнении с прямым подсчетом является бо­лее достоверным методом, вследствие чего этот способ наиболее распространен в микробиологической практике.

После подсчета колоний на чашке, полученных в результате посева того или иного продукта, проводят качественный анализ наиболее характерных групп бактерий и грибов, выросших на МПА, СА или агаре Чапека.

Для этой цели выбирают 1-2 колоний бактерий, хорошо изолированных друг от друга (из числа выросших на чашке в наибольшем количестве). Выбранные колонии отмечают карандашом со дна чашки и описывают их морфологические и культуральные признаки.

Учитывая, что каждый вид бактерий образует свои, характерные для него по внешнему виду колонии, при описании их отмечают следующие признаки:

1.Размер колоний (их диаметр)

2.Форма колоний (круглая, овальная, неправильная, мицелевидная и др.)

3.Цвет колоний (белый, желтый, кремовый, розовый и др.)

4.Поверхность колоний (гладкая, блестящая, матовая, складчатая, мучнистая и др.)

5.Край колоний (ровный, волнистый, зубчатый, лопастной и др.). Изучают в открытых чашках при малом увеличении микроскопа - 8х.

6. Консистенция колоний (слизистая, крошащаяся, пастообразная и др.). Определяется в процессе приготовления мазка.

Из описанных колоний готовят фиксированные, окрашенные препараты, или препараты в раздавленной капле и смотрят с иммерсионным объективом (см. работу 2).

Описание внешнего вида и микроскопирование колоний дрожжей и ми-целиальных (плесневых) грибов проводится согласно методов, приведенных в работе 3 и 4.

 

Работа 7. ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ И

МЕТОДОВ ЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ В НЕКОТОРЫХ ОСНОВНЫХ ВИДАХ ПИЩЕВОГО СЫРЬЯ И ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ НЕГО ПРОДУКТОВ

Известно, что разные виды пищевого растительного и животного сырья, используемого в пищевой промышленности, имеют сложный и разнообразный химический состав, а также существенно различаются содержащейся в сырье и продуктах многообразной, а иногда и специфичной микрофлорой. Ввиду этого требуется уточнение и детализация стандартных методов определения некоторых групп (или видов) микроорганизмов, применительно к тому или иному продукту.

Очевидно, что при выборе продукта для изучения его микрофлоры, в первую очередь следует использовать сырье и продукты, соответствующие той отрасли промышленности, по которой специализируется студент (хлебопекарная, молочная, рыбная и тд.).

Микрофлора зерна и муки и методы ее определения

Типичной микрофлорой доброкачественного свежеубранного зерна являются эпифитные бактерии рода Erwinia (Erwinia herbicola) или «травяная палочка». Количество этих бактерий иногда составляет 90% от общего числа микроорганизмов на зерне, что в определенной степени является показателем свежести зерна и его хорошего качества. Из числа грибов на зерне сразу после уборки выявляются преимущественно т.н. «полевые грибы» - представители класса несовершенных грибов - роды Alternaria, Cladosporium, Dematium и др. При уборке зерна в условиях высокой влажности на нем из числа грибов преобладают грибы рода Fusarium, Helminthosporium_r которые разрушают зародыш и резко снижают всхожесть зерна уже в период его уборки.

При дальнейшем хранении зерна, прошедшего своевременную необходимую послеуборочную обработку (очистку, вентилирование, подсушивание и т.д.), эпифиты и полевые грибы на нем постепенно, а иногда довольно быстро, исчезают.

Общее количество микроорганизмов снижается. Из числа бактерий выявяются в небольших количествах спорообразующие палочки типа Bacillus sub-tills, Bacillus mycoides и др. Среда грибов - преобладают плесени хранения – виды Aspergillus, Penicillium, Rhisopus. Наиболее активное развитие плесеней хранения и гнилостны бацилл происходит при самосогревании зерна, когда температура в насыпи достигает 30° - 40°С и более. В процессе самосогревания резко ухудшается качество зерна – оно темнеет, слеживается, приобретает посторонние запахи и вкус.

Количественный и качественный состав микрофлоры муки зависит от степени обсемененности микроорганизмами зерна, а также от сортности помола. Поскольку основная масса микробов находится на поверхности зерна, то в высокосортной муке всегда меньше микробов, чем в муке низкосортной, содержащей большее количество отрубей. Обсемененность муки микрофлорой сильно варьирует не только в зависимости от сорта, но и от условий влажности, температуры и продолжительности хранения. При хранении муки с влажностью выше стандартной (14-15%) происходит размножение микробов, что приводит к комкованию, слеживанию продукта. При более активном развитии микрофлоры возникают различные пороки муки - плесневение, прогоркание, прокисание.

Наиболее опасными среди бацилл являются разновидности Bacillus Subtilits, которые попадают в муку при помоле зерна, подверга- вшегося(самосогрева­нию. Вегетативные клетки гнилостных бацилл погибают при t = 98- 100°, которая создается в мякише при выпечке хлеба.

Однако, термоустойчивые споры бацилл переносят нагревание до 120°С. Сохраняясь в хлебе они при недостаточном охлаждении и задержке реализации развиваются в мякише пшеничного хлеба, разлагают белки и крахмал, образуют слизистые вещества – декстрины. В результате мякиш хлеба приобретает гнилостный запах и тягучую консистенцию. Гнилостные бациллы составляют специфическую микрофлору муки. Поэтому в практике хлебопечения каждую партию муки проверяют на наличие спор указанных бацилл. На основании полученных результатов дается оценка качества муки по микробиологическому показателю – количество спор бацилл в 1 г. муки.

При наличии в 1 г. муки до 200 спор-мука считается нормальной От 200 до 1000 спор – мука сомнительная От 1000 спор и более - мука сильно заражена спорами не должна использоваться для выпечки крупно-штучных изделий (буханок, батонов и пр.)

Такая мука может быть использована для мелкоштучных изделий с низ­кой влажностью (сухари, баранки, сушки и пр.)

Задание

1.Провести описанным выше способом (раб.6) посев смыва с свежеубранного (или текущего года уборки) зерна пшеницы на МПА и агар Чапека, для учета количества колоний бактерий и грибов.

2.Подобным образом провести посев смыва зерна пшеницы, ранившегося в течение не менее 2-3 лет. Сравнить количественный и групповой состав микрофлоры.

3.Выбрать 2-3 наиболее характерные колонии бактерий и грибов. Описать их (см. выше). Сделать препараты для микроскопирования. Для бактерий – фиксированные препараты, окрашенные фуксином. Для грибов препараты в раздавленной капле, смотреть с объективами 8х и 40х. Зарисовать. На основании описании и микроскопирования преобладающей микрофлоры сделать ориентировочную оценку качества зерна.

4.Провести посев смыва с муки для определения в ней общего количества микроорганизмов.

5.Провести посев муки для определения в ней количества спор гнилостных бацилл, типа Bacillus Subtilis. Для этой цели следует приготовить суспензию навески муки в 100 мл. стерильной воды (см. выше). Полученную суспензию пастеризовать на водяной бане при 80°С в течении 10 минут (для уничтожения вегетативных клеток бактерий, а также дрожжей и грибов). Из прогретого образца сделать посевы на МПА, поместить чашки в термостат с t = 30-35°С.

Выросшие колонии подсчитать и сделать пересчет на 1 г муки. Дать оценку качества муки. Колонии описать, приготовить из них фиксированные препараты с окрашиванием фуксином, микроскопировать с иммерсией. Зарисовать.

 

Микрофлора молока, молочных продуктов и методы ее определения

Молоко по своей питательной ценности представляет идеальный продукт для живых организмов в т.ч. микроорганизмов. Молоко в вымени здоровой коровы практически стерильно. рН свежего молока - 6, 8. Однако, сразу после дойки молоко в той или иной степени загрязняется микрофлорой из внешней среды: шерсти животного, корма, доильного оборудования и т.д.

В молоке, полученном при соблюдении санитарных правил преобладают микрококки, в небольшом числе содержатся молочнокислые стрептококки, сарцины и др.

Загрязненное молоко может содержать значительное количество бактерий группы кишечной палочки, молочнокислых, масляно-кислых и гнилостных бактерий. Во время последующего хранения молока изменяется количество содержащихся в нем бактерий и соотношение между отдельными видами. Характер этих изменений зависит от температуры, продолжительности хранения и состава микрофлоры при получении. Следует отметить несколько фраз:

Бактерицидная фаза: сразу после дойки число бактерий в молоке не возрастает и даже иногда снижается. Это объясняется тем, что в свежевыдоенном молоке содержаться бактерицидные вещества – лактенины, лизоцим и др. способные подавлять развитие бактерий.

Продолжительность бактерицидной фазы зависит от количественной обсемененности молока микрофлорой и температуры его хранения. Установлено, что чем быстрее молоко охлаждают после дойки, тем более продолжительной становится его бактерицидная фаза. Например, если в молоке с t° - 35°С (парное) бактерицидная фаза продолжается всего до 3 час., то при охлаждении молока до 5°С бактерицидная фаза достигает 36 часов. Чтобы продлить бактерицидную фазу рекомендуется возможно скорее охладить молоко по крайней мере до 10°С.

По окончании бактерицидной фазы наступает фаза смешанной микрофлоры. При этом развивается все микроорганизмы, попавшие в молоко. Но постепенно начинают преобладать молочнокислые бактерии. В конце фазы отмечается повышение кислотности молока и наступает фаза молочнокислых бактерий. В этой фазе молочнокислые бактерии быстро развиваются и подавляют другие микроорганизмы. Молоко при этом сквашивается.

Разные виды молочнокислых бактерий образуют разное количество молочной кислоты, что объясняется их неодинаковой кислотоустойчивостью. Более устойчивы гомоферментативные палочковидные бактерии, они образуют до 2 - 3, 5% молочной кислоты, в то время как молочнокислые стрептококки лишь до 1%. По отношению к температуре молочнокислые можно разделить на мезофильные с оптимум роста при 25-35°С и термофильные – оптимум 40-45°С. Разные виды молочнокислых бактерий представлены на рис. 18.

При дальнейшем хранении молока с увеличением концентрации молочной кислоты подавляется развитие самих молочнокислых бактерий, число их начинает снижаться. В первую очередь отмирают молочнокислые стрептококки (Streptococus lactis, Str.cremoris). Молочнокислые палочки более устойчивы к кислотности среды и отмерают медленнее. В конце концов на сквашенном молоке создаются условия для развития ложных дрожжей и плесневых грибов. Рост бактерий подавляется. В результате развития грибов Oidium lactis, видов Penicillium и др. кислотность молока снижается, вследствие потребления ими молочной кислоты.

В результате создаются благоприятные условия для развития гни­лостных бактерий, которые ускоряют процесс распада белков молока, что приводит продукт к окончательной порче.

В молоке сохраняемом при t° ниже 10-8°С молочнокислые почти не размножаются, что способствует развитию холодостойких бактерий рода Pseudomonas или масляно-кислых клостридий, вызывающих прогоркание продукта.

В зависимости от задач, поставленных перед лабораторией, анализ молока на микрофлору проводят с большей или меньшей детальностью. Для тех случаев, когда надо быстро дать заключение потребителю о качестве молока или при массовом контрольном обследовании (анализ молока, сдаваемого поставщиками на рынок или на завод для переработки) приемлемы приблизительные методы определения бактерицидной чистоты и свежести молока, наиболее быстрые и легкие в исполнении – определение кислотности молока титрованием по Тернеру, метод редуктазной пробы, а также непосредственный подсчет общего количества микроорганизмов в 1 мл. молока Учетной камере под микроскопом.

В настоящее время в соответствии с требованиями Сан Пин (1997 г.) в молоке и молочных продуктах определяют следующие микробиологические показатели: КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно-аэробных микроорганизмов); БГКП (бактерии группы кишечной палочки); КПС (коогулязоположительный стафилококк).

Каждую группу определяют по соответствующей методике КМАФАнМ -методом посева и учета бактерий на МПА с мелом (для выявления молочно­кислых бактерий к основной среде добавляют 2-3% мела).

Метод выявления БГКП в молоке и молочных продуктах основан на способности бактерий кишечной группы сбраживать лактозу в среде Кеслера (см. приложение) с образованием кислоты и газа. По 1 мл. пастеризованного молока засеивают в пробирки с 5мл среды Кеслера и помещают в термостат при 37°С на 24 часа. После чего пробирки просматривают и по наличию в них газообразования предположительно судят о присутствии БГКП. Для идентификации из пробирок, в которых наблюдается брожение проводят посев на диагностическую плотную среду Эндо. Из каждой пробирки с признаками роста делают пересев петлей на поверхность плотной среды. Одну чашку можно использовать для высева одновременно Зх пробирок, разделив дно чашки карандашом на секторы. Посевы на плотных среда проводят таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы выдерживают в термостате при 37°С в течении 24 часов, после чего просматривают и отмечают рост колоний характерных для группы БГКП - на среде Эндо колонии плоские или слегка выпуклые или с валиком, бесцветные или красные с различной интенсивностью окраски, с металлическим или без металлического блеска. Из подозрительных колоний делают фиксированные препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют с иммерсией. При обнаружении грамотрицательных палочек считают, что в продукте присутствуют БГКП. Результат записывают как «обнаружены (не обнаружены) БГКП в анализируемой массе продукта».

При обнаружении бесцветных колоний на чашках со средой Эндо в условиях работы лабораторий, расположенных на территории молочных предприятий, во избежание пропуска патогенных бактерий семейства кишечных палочек, указанные чашки должны передаваться лаборатории СЭС для дальнейшего изучения.

Для определения присутствия в молоке и продуктах (например сухом молоке) коагулязоположительных (гемолитических) стафилококков делают посев исследуемого продукта обычным способом (раб.6) (с разведением не более 1: 10) на диагностические среды: мелочно-солевой агар, или желточно-солевой агар, или МПА с 5-10% дефибринированной крови (бычьей, кроликов и др.). Посевы выращивают в термостате при 37°С в течение 24-28 часов. После 48 часов колонии подсчитывают и делают пересчет на 1 г. или 1 мл. исследуемого продукта. Затем проводят изучение и описание внешнего вида колоний. Колонии, характерные для Staphylococcus aureus на молочно (желточно) солевом агаре выглядят как довольно крупные (2-4 мм в диаметре), плоские, блестящие, окруженные радужной зоной, окрашенные от белого до лимонно-желтого и оранжевого цветов. Фиксированные препараты, приготовленные из колоний окрашивают по Граму и микроскопируют с иммерсией. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (грам +), клетки имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями (гроздьями). При выявлении стафилококков в оп­ределенной массе (объеме) продукта результаты записывают как «обнаружены (не обнаружены) стафилококки типа Staphylococcus aureus в анализируемой массе продукта».

 

Lactobаcillus bulgaricum после культивирования при 40°С в молоке: а) стериальном; б) пастеризованном при 80°С. препараты окрашены метиленовой синью.

 

Колонии Str. Lactis на агаре с мелом. Видны зоны растворения мела вокруг колоний.

 

 

Streptococcus Lactis – молочнокислый стрептококк в мазке из кислого молока.

 

Streptococcus cremoris. Длинные цепочки. Молоко.

 

 

Lactobаc plantarum. Короткие палочки, расположенные цепочками. Сусло.

 

 

Lactobаc breve. Короткие палочки с закругленными концами.

Рис. 18. Молочнокислые бактерии (Lactobаcillus).

 

Задание

1.Определить общее количество микроорганизмов, в т.ч. молочнокислых бактерий в пастеризованном и сухом молоке, путем непосредственного посева продукта (для сухого молока посев смыва) на плотную среду МПА с мелом.

2.Сделать посев в пробирки (или колбочки) с жидкой средой Кесслера образцов пастеризованного молока, сухого молока, творога для выявления БГКП.

В случае обнаружения в пробирках и колбах признаков брожения – сделать пересев на среду Эндо. Из выросших колоний сделать препараты, окрасить по Граму. Смотреть с иммерсией, сделать заключение.

3.Для выявления КПС в молочных продуктах сделать посевы образцов – пастеризованного и сухого молока, сухих сливок на молочно (желточый)солевой агар или агар с кровью. Выращивать при t = 37°C в течение 48 часов. Из выросших колоний сделать фиксированные препараты, окрасить фуксином и по Граму. Смотреть с иммерсией. Зарисовать.

4.Сделать фиксированные препараты непосредственно из разных видов молочнокислых продуктов - кефира, йогурта, ацидофилина, продуктов, изготовленных с применением бифидобактерий. Покрасить метиленовой синью. Смотреть с объективом 40х или с иммерсией. Зарисовать.

 

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: